Pendahuluan

Demam Berdarah Dengue (DBD) merupakan penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus dengue dari genus Flavivirus dan ditularkan terutama melalui gigitan nyamuk Aedes aegypti [1]. Data WHO mencatat peningkatan jumlah kasus dengue dari 505.430 kasus pada tahun 2000 menjadi sekitar 14,6 juta kasus pada tahun 2024. Bahkan pada periode Januari – Juli 2025 saja, tercatat lebih dari 4 juta kasus dengue dan lebih dari 3.000 kematian dari 97 negara [1]. Di Indonesia sendiri, Provinsi Jawa Timur tercatat memiliki incidencerateDBD sebesar 78,83 per 100.000 penduduk pada tahun 2024, angka ini menjadi salah satu yang tertinggi secara nasional [19], sehingga upaya diagnosis dini di daerah ini tetap penting untuk terus ditingkatkan. Gejala awal dengue umumnya berupa demam tinggi, nyeri otot dan sendi, sakit kepala, ruam kulit, hingga perdarahan ringan, yang seringkali mirip dengan gejala penyakit infeksi lain [3].

Karena gambaran klinis dengue mudah tertukar dengan penyakit infeksi lain, pemeriksaan laboratorium menjadi bagian penting untuk memastikan diagnosis. Pemeriksaan yang biasa digunakan antara lain pemeriksaan hematologi, deteksi antigen NS1, pemeriksaan antibodi IgM dan IgG, serta pemeriksaan molekuler [2][3]. Pemeriksaan hematologi seperti jumlah trombosit dan kadar hematokrit sebenarnya kurang spesifik untuk dengue, sehingga posisinya lebih sebagai pemeriksaan penunjang saja [3]. Antigen NS1 baru bisa diandalkan pada fase awal infeksi, sementara IgM dan IgG baru terbentuk beberapa hari setelah infeksi berlangsung, sehingga tidak bisa dipakai untuk deteksi dini [3]. Masing – masing metode ini, baik ELISA, NS1, maupun PCR, memiliki kelebihan dan keterbatasannya sendiri, sehingga pemilihan metode perlu disesuaikan dengan fase infeksi pasien [2].

Di antara metode – metode tersebut, pemeriksaan molekuler dianggap paling unggul karena dapat mendeteksi materi genetik virus secara langsung selama fase viremia, biasanya menggunakan sampel whole blood karena virus dengue banyak beredar di sirkulasi darah pada fase ini [4][12]. Karena genom virus dengue berupa RNA, pemeriksaan RT-PCR memerlukan tahap reverse transcription untuk mengubah RNA menjadi complementary DNA (cDNA) sebelum bisa diamplifikasi [5][6]. Selain mendeteksi keberadaan virus, RT-PCR konvensional juga bisa digunakan untuk menentukan serotipe dengue yang menginfeksi pasien [5]. Namun keberhasilan pemeriksaan ini sangat bergantung pada kecocokan primer dengan gen target serta kondisi amplifikasi yang dipakai [7].

Kemampuan RT-PCR konvensional dalam mendeteksi virus dengue turut dipengaruhi oleh pemilihan wilayah target amplifikasi, sebagaimana ditunjukkan pada penelitian yang membandingkan tiga primer berbeda untuk deteksi dan serotyping virus dengue pada 171 anak dengan kecurigaan klinis dengue di India [23]. Primer yang menargetkan gen C–prM berukuran 511 bp berhasil mendeteksi 59,5% dari sampel yang telah dikonfirmasi positif secara serologis. Ukuran primer ini sama dengan yang dipakai pada penelitian ini, sementara primer C–prM berukuran 654 bp pada penelitian tersebut justru menunjukkan kemampuan deteksi yang lebih tinggi, yaitu 75,2% [23]. Temuan tersebut menunjukkan bahwa kemampuan RT-PCR konvensional dalam mendeteksi dengue tidak semata-mata ditentukan oleh keberadaan target gen, tetapi juga oleh pemilihan wilayah target serta ukuran produk amplifikasi yang digunakan.

Selain RT-PCR, metode molekuler lain yang belakangan mulai banyak digunakan untuk deteksi dengue adalah RT-LAMP (reverse transcription loop-mediated isothermal amplification). Berbeda dengan RT-PCR yang memerlukan mesin thermal cycler untuk mengatur perubahan suhu berulang, RT-LAMP bekerja pada suhu konstan dan menggunakan beberapa pasang primer yang menempel pada beberapa titik di sepanjang gen target, sehingga reaksinya berlangsung lebih cepat dan hasilnya bisa langsung diamati lewat perubahan warna tanpa perlu elektroforesis [8][10]. Hal ini didasarkan pada penelitian yang pertama kali mengembangkan metode LAMP, yang menunjukkan bahwa penggunaan serangkaian primer khusus yang mengenali beberapa wilayah berbeda pada DNA target memungkinkan amplifikasi berlangsung secara spesifik, efisien, dan cepat pada kondisi suhu tetap, tanpa memerlukan tahap denaturasi panas seperti pada PCR konvensional [24]. Karena tidak bergantung pada peralatan yang rumit, RT-LAMP dinilai lebih praktis digunakan di fasilitas kesehatan dengan sumber daya terbatas, dan penelitian melaporkan sensitivitas RT-LAMP yang sebanding atau bahkan lebih baik dibandingkan RT-PCR pada sampel dengue [9][16].

Selain metode yang digunakan, kondisi penyimpanan sampel juga menjadi faktor yang tidak kalah penting untuk diperhatikan, karena berkaitan langsung dengan kualitas RNA yang akan diperiksa [13][14]. RNA yang mengalami penurunan kualitas dapat menghambat proses reverse transcription, sehingga jumlah target yang berhasil diamplifikasi pada RT-PCR ikut berkurang [13]. Selain itu, media transportasi, suhu, dan lama penanganan sampel sebelum diperiksa juga ikut memengaruhi kestabilan materi genetik virus [14], ditambah lagi proses beku-cair (freeze-thaw) yang berulang justru mempercepat kerusakan RNA [15]. Beberapa penelitian sebelumnya membuktikan keterkaitan antara lama penyimpanan dan penurunan kualitas RNA ini. Kualitas RNA sampel darah dilaporkan mulai menurun setelah disimpan lebih dari 24 jam, dan penyimpanan pada suhu rendah tidak sepenuhnya mampu mencegah degradasi tersebut [17]. Hasil penelitian lain menunjukkan kestabilan RNA virus pada sampel darah juga berkurang seiring waktu, meski RNA masih relatif stabil sampai sekitar 72 jam penyimpanan pada suhu 0–4°C [18]. Penelitian yang secara khusus meneliti virus dengue melaporkan hasil yang sedikit berbeda, yaitu RNA dengue pada sampel

darah yang disimpan dalam bentuk kering di atas kertas saring tetap stabil dan masih dapat dideteksi melalui RT-PCR hingga 9 minggu penyimpanan, baik pada suhu ruang, 4°C, maupun −70°C [27]. Meskipun demikian, penelitian tersebut menggunakan metode penyimpanan berbeda (darah kering pada kertas saring, bukan sampel cair langsung) dari yang digunakan pada penelitian ini, sehingga belum banyak penelitian yang secara langsung membandingkan kemampuan deteksi RT-PCR konvensional dengan RT-LAMP pada sampel dengue klinis cair dengan variasi waktu penyimpanan yang jelas.

Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi kemampuan deteksi virus dengue pada sampel yang disimpan selama ≥72 jam serta membandingkan kinerja metode RT-PCR konvensional dan RT-LAMP dalam mendeteksi virus tersebut. Selain itu, penelitian ini menganalisis kemungkinan pengaruh degradasi RNA dan karakteristik daerah target amplifikasi terhadap perbedaan hasil deteksi yang diperoleh dari kedua metode.

Metode

Penelitian ini menggunakan desain kualitatif komparatif laboratorik. Penelitian ini telah melalui uji ke-laikan etik (ethical clearance) yang diterbitkan oleh Komisi Kelaikan Etik Penelitian dan Kesehatan (KKEPK) Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya dengan nomor 0609/HRECC.FODM/VI/2026. Pengambilan sampel dilaksanakan pada bulan Mei – Juni 2026, sedangkan analisis laboratorium yang meliputi ekstraksi RNA, pemeriksaan RT-PCR, dan RT-LAMP dilaksanakan pada bulan Juni – Juli 2026. Sampel penelitian merupakan pasien terduga DBD yang diperoleh dari Rumah Sakit Bhayangkara Pusdik Sabhara Porong, kemudian diperiksa di Laboratorium Biologi Molekuler Program Studi D-IV Teknologi Laboratorium Medis, Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Sidoarjo. Pengambilan sampel dilakukan dengan metode purposive sampling berdasarkan kriteria klinis dan kualitas spesimen, dengan jumlah sampel yang digunakan sebanyak 30 sampel pasien terduga DBD.

Kriteria inklusi dalam penelitian ini meliputi pasien berusia ≥1 tahun dengan diagnosis klinis terduga DBD, mengalami demam akut selama 2–7 hari disertai minimal dua gejala klinis dengue, serta berada pada fase febril, yaitu fase demam akut yang berlangsung selama 2–7 hari sejak onset demam. Selain itu, pasien juga harus memiliki hasil pemeriksaan hematologi yang menunjukkan adanya trombositopenia, yaitu jumlah trombosit kurang dari 150.000/µL. Kriteria eksklusi dalam penelitian ini meliputi sampel dengan hemolisis berat, volume yang tidak mencukupi untuk ekstraksi RNA, mengalami kontaminasi, atau kondisi lain yang dapat menurunkan mutu hasil ekstraksi RNA.

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tabung vacutainer EDTA untuk pengambilan sampel darah, cooler box dan ice pack untuk transportasi sampel dari rumah sakit ke laboratorium, lemari pendingin (refrigerator) untuk menyimpan sampel pada suhu 0–4°C, mikropipet dan tip berbagai ukuran, tabung mikrosentrifus (microtube), vortex mixer, sentrifuge, mesin PCR Bio-Rad T100 untuk proses reverse transcription dan amplifikasi, perangkat elektroforesis gel agarosa, serta UV transilluminator untuk memvisualisasikan hasil amplifikasi RT-PCR. Bahan yang digunakan meliputi kit ekstraksi RNA merek TIANGEN yang terdiri atas buffer R2, kloroform, etanol, spin column, buffer pencuci RD, RW1, dan RW2, serta RNase-free ddH₂O. Pada pemeriksaan RT-PCR konvensional, bahan yang digunakan meliputi PCR-mix, enzim reverse transcriptase, sepasang primer spesifik virus dengue (forward dan reverse), nuclease-free water, agarosa 1%, buffer TBE, gel red sebagai pewarna DNA, serta DNA ladder 100 bp sebagai penanda ukuran. Pada pemeriksaan RT-LAMP, bahan yang digunakan meliputi buffer reaksi, enzim dengan aktivitas strand dis-placement dan reverse transcription, nuclease-free water, serta enam primer spesifik virus dengue yang terdiri atas F3, B3, FIP, BIP, LoopF, dan LoopB.

Ekstraksi RNA dilakukan menggunakan kit ekstraksi RNA (TIANGEN, China). Sebanyak 250 µL sampel (serum atau darah utuh) dicampurkan dengan 750 µL buffer R2, kemudian divortex dan diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Selanjutnya, ke dalam campuran tersebut ditambahkan 200 µL kloroform, divortex kembali, diinkubasi selama 3 menit, lalu disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk kemudian ditambahkan etanol sebanyak 0,5 kali volumenya, lalu dimasukkan ke dalam spin column. Kolom dicuci secara berturut – turut menggunakan buffer RD, RW1, dan RW2, kemudian disentrifugasi kembali untuk menghilangkan sisa larutan pencuci. Tahap akhir dilakukan dengan mengelusi RNA menggunakan 30–100 µL RNase-free ddH₂O.

Setelah dilakukan ekstraksi RNA, sampel disimpan pada suhu 0–4°C dengan enam variasi lama penyimpanan, yaitu 72 jam, 96 jam, 120 jam, 144 jam, 168 jam, dan 192 jam, sebelum digunakan pada pemeriksaan RT-PCR dan RT-LAMP. Lama penyimpanan tiap sampel dicatat dalam satuan jam untuk memungkinkan analisis berdasarkan durasi aktual. Pemeriksaan Pemeriksaan RT-LAMP dilakukan dalam volume reaksi total 25 µL, dengan komposisi 2× PCR-mix sebanyak 12,5 µL, RNA hasil ekstraksi sebagai template sebanyak 3,0 µL, enzim M-MuLV RT sebanyak 1,0 µL, enzim Bst 2.0 sebanyak 1,0 µL, primer FIP sebanyak 2,0 µL, primer BIP sebanyak 2,0 µL, LoopF sebanyak 1,0 µL, LoopB sebanyak 1,0 µL, F3 sebanyak 0,5 µL, B3 sebanyak 0,5 µL, dan sisanya nuclease-free water hingga mencapai volume akhir 25 µL. Keenam primer tersebut terdiri atas dua primer luar (outer primer), yaitu F3 (5'-AGTTTTTGTGAGGGTGGTG-3') dan B3 (5'-CCGACCTCCTTCTCCTTTG-3'), lalu dua primer dalam (inner primer), yaitu FIP (5'-TCTAAGCTTCGAGTGAGGAGCTTAAGATGGTTTCAACGAT-3') dan BIP (5'-

GGTTTGGTTTGGTTTTGGTTTGGGTTTCTAGTTGGTCTCA-3'); serta dua loop primer, yaitu LoopF (5'-

TGGTTCTGGTGGTGACTC-3') dan LoopB (5'-CCTCTTTCTTTGAGCTCT-3'). Seluruh komponen reaksi dicampurkan dalam satu tabung, kemudian dipanaskan menggunakan waterbath pada suhu 60°C selama 60 menit, dilanjutkan dengan pemanasan pada suhu 80°C selama 2 menit. Setelah proses inkubasi selesai, ke dalam campuran reaksi ditambahkan gel red dengan pengenceran 100 kali sebanyak 0,5 µL sebagai indikator visualisasi warna. Selama proses inkubasi berlangsung, terjadi reaksi reverse transcription dan amplifikasi secara bersamaan, sehingga RNA target langsung diperbanyak tanpa memerlukan tahap pembentukan cDNA secara terpisah. Hasil amplifikasi diamati secara visual berdasarkan perubahan warna larutan, dengan perubahan warna menjadi merah muda (pink) menunjukkan hasil positif, sedangkan warna yang tetap ungu menunjukkan hasil negatif.

Pemeriksaan RT-PCR konvensional diawali dengan tahap reverse transcription, yaitu proses mengubah RNA hasil ekstraksi menjadi complementary DNA (cDNA), dengan volume reaksi total 25 µL yang terdiri atas 2× PCR-mix sebanyak 12,5 µL, RNA hasil ekstraksi sebanyak 5 µL, forward primer sebanyak 1 µL, reverse primer sebanyak 1 µL, enzim reverse transcriptase sebanyak 0,5 µL, dan nuclease-free water sebanyak 5 µL. Reaksi reverse transcription dilakukan pada suhu 55°C selama 60 menit, dilanjutkan dengan inaktivasi enzim pada suhu 70°C selama 5 menit. Selanjutnya, cDNA yang terbentuk diamplifikasi menggunakan mesin PCR Bio-Rad T100 dengan sepasang primer spesifik virus dengue yang menargetkan gen C–prM (capsid–premembrane), dimana terdiri dari forward primer 5'-TCAATATTGCTGAAACGCGAGAGAAACCCG-3'danjugareverseprimer 5'TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3', dengan produk amplifikasi yang diharapkan berukuran 511 bp. Program amplifikasi PCR terdiri atas denaturasi awal pada suhu 94°C selama 2 menit, dilanjutkan dengan 40 siklus yang masing-masing terdiri atas denaturasi pada suhu 94°C selama 45 detik, annealing pada suhu 55°C selama 1 menit, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit, kemudian diakhiri dengan ekstensi akhir pada suhu 72°C selama 7 menit. Produk amplifikasi selanjutnya dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa 1% dalam buffer TBE pada tegangan 100 volt selama 30 menit, kemudian divisualisasikan menggunakan UV transilluminator. Sampel dinyatakan terdeteksi positif apabila terbentuk pita DNA pada ukuran 511 bp yang sejajar dengan marker 100 bp, sedangkan sampel dinyatakan tidak terdeteksi apabila pita DNA pada ukuran tersebut tidak muncul.

Data disajikan dalam bentuk frekuensi dan persentase untuk hasil terdeteksi, tidak terdeteksi, dan tidak valid. Perbedaan hasil berpasangan antara RT-PCR konvensional dan RT-LAMP dianalisis menggunakan uji McNemar (exact), karena kedua pemeriksaan dilakukan pada sampel yang sama dan menghasilkan data kat-egorik berpasangan. Hubungan antara lama penyimpanan sampel dengan hasil pemeriksaan RT-LAMP diana-lisis menggunakan uji Fisher–Freeman–Halton (exact) dengan pendekatan Monte Carlo, mengingat jumlah sel dengan frekuensi harapan kurang dari 5 cukup banyak pada tabulasi silang. Nilai p<0,05 digunakan sebagai batas kemaknaan statistik pada seluruh pengujian.

Hasil dan Pembahasan

Sebanyak 30 sampel diperiksa menggunakan RT-PCR konvensional dan RT-LAMP. Hasil menunjukkan bahwa hampir seluruh sampel pada RT-PCR konvensional tidak memperlihatkan pita DNA target pada elektroforesis gel agarosa, kecuali satu sampel (sampel nomor 27) yang menunjukkan pita DNA jelas pada ukuran 511 bp. Dari 30 sampel yang diperiksa, hanya 1 sampel (3,3%) yang terdeteksi positif melalui RT-PCR konvensional, sedangkan 29 sampel lainnya (96,7%) tidak menunjukkan hasil amplifikasi. Sementara itu, pemeriksaan RT-LAMP menunjukkan hasil positif pada 26 sampel (86,7%) dan negatif pada 4 sampel (13,3%). Rincian distribusi kedua hasil pemeriksaan berdasarkan lama penyimpanan sampel disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1. Distribusi Hasil RT-LAMP dan RT-PCR Berdasarkan Lama Penyimpanan Sampel, serta Hasil Uji Fisher–Freeman–Halton terhadap Hubungan Lama Penyimpanan dengan Hasil RT-LAMP

Persentase pada tiap baris kelompok waktu dihitung terhadap jumlah sampel dalam kelompok tersebut (n=5), sedangkan persentase pada baris Total dihitung terhadap keseluruhan sampel penelitian (n=30). RT-PCR dinyatakan negatif apabila tidak terbentuk pita DNA pada ukuran target 511 bp, termasuk kondisi yang menunjukkan pola smear akibat degradasi RNA. Uji Fisher–Freeman–Halton pada tabel 1 digunakan untuk menguji hubungan antara lama penyimpanan dengan hasil RT-LAMP, dan tidak diterapkan pada data RT-PCR karena hampir seluruh sampel menunjukkan hasil negatif sehingga variasi datanya tidak memadai untuk diuji secara statistik.

Dari Tabel 1 terlihat bahwa RT-LAMP tetap mampu mendeteksi virus dengue pada seluruh kelompok waktu penyimpanan (72–192 jam), dengan proporsi hasil positif sebesar 60% pada kelompok 72 jam, meningkat menjadi 80% pada kelompok 96 jam dan 192 jam, serta mencapai 100% pada kelompok 120, 144, dan 168 jam. RT-PCR konvensional menunjukkan pola yang jauh berbeda: hanya satu sampel positif yang ditemukan, yaitu pada kelompok 72 jam, sementara seluruh kelompok waktu lainnya tidak menunjukkan hasil amplifikasi sama sekali. Penurunan kemampuan deteksi RT-PCR ini sudah terjadi sejak durasi penyimpanan paling pendek yang diuji, dan berlanjut konsisten hingga durasi terpanjang, kondisi ini dapat dijelaskan oleh sifat RNA virus yang memang rentan terdegradasi seiring bertambahnya waktu penyimpanan [13][14]. Elektroforesis RT-PCR pada penelitian ini dijalankan secara bertahap sesuai kelompok lama penyimpanan sam-pel, sehingga hasil visualisasi pada Gambar 1 mewakili kondisi amplifikasi masing-masing kelompok waktu secara representatif, bukan hasil dari satu kali proses running gabungan seluruh sampel.

Secara keseluruhan, RT-LAMP mampu mendeteksi virus dengue pada 26 dari 30 sampel (86,7%), sedangkan RT-PCR konvensional hanya mendeteksi 1 dari 30 sampel (3,3%). Hasil RT-PCR yang sebagian besar tidak terdeteksi tidak menunjukkan bahwa metode tersebut kurang baik, melainkan menunjukkan bahwa keberhasilan RT-PCR sangat bergantung pada keutuhan RNA pada satu wilayah target, yang rentan terganggu oleh proses penyimpanan [13][14]. Pola ini sejalan dengan laporan penelitian dengue terdahulu, yang mendapati sensitivitas RT-LAMP setara atau bahkan melampaui RT-PCR pada sampel klinis, termasuk pada kondisi sampel dengan kualitas yang tidak lagi optimal [16][20]. Dengan demikian, RT-LAMP dapat dipertimbangkan sebagai metode alternatif yang lebih andal untuk deteksi virus dengue, khususnya pada kondisi sampel yang telah mengalami penundaan pemeriksaan atau penyimpanan dalam durasi cukup lama.

Figure 1.

Gambar 1.Visualisasi produk amplifikasi RT-PCR konvensional pada gel agarosa.

Produk amplifikasi target menunjukkan ukuran pita sebesar 511 bp berdasarkan penanda ukuran DNA (DNA ladder).

Kontrol positif (CP) pada penelitian ini menggunakan sampel pasien yang sebelumnya dinyatakan positif dengue, bukan reagen kontrol komersial yang sudah terstandarisasi. Penggunaan sampel klinis sebagai kontrol positif umum dilakukan ketika kontrol standar tidak tersedia. Namun, pendekatan ini memiliki keterbatasan karena stabilitas dan konsentrasi RNA target pada sampel klinis tidak selalu konsisten seperti pada kontrol sintetis atau komersial yang telah dikalibrasi [21]. Dengan demikian, status positif pada kontrol tersebut tidak dapat ditentukan secara spesifik berdasarkan jenis antibodi (IgG atau IgM) maupun keberadaan antigen NS1 karena tidak dilakukan pemeriksaan lanjutan untuk membedakan parameter tersebut. Terdapat kemungkinan bahwa sampel kontrol positif telah mengalami penurunan kualitas sebelum atau selama proses ekstraksi RNA, sehingga hasil amplifikasi menunjukkan pola smear pada elektroforesis, bukan pita tunggal yang spesifik [13][14]. Pola serupa juga dilaporkan pada penelitian yang mengulas pengaruh integritas RNA terhadap kinerja RT-PCR, yang menunjukkan bahwa RNA dengan tingkat degradasi tinggi cenderung menghasilkan pola pita yang bergeser ke arah fragmen berukuran lebih kecil dan tampak sebagai pita yang tidak jelas atau menyebar pada hasil elektroforesis, alih-alih pita tunggal yang tajam [25].

Berbeda dari sampel lain, sampel nomor 27 pada gambar elektroforesis menunjukkan pita DNA yang jelas pada posisi sekitar 511 bp, sejajar dengan marker 100 bp. Munculnya pita pada posisi tersebut berarti fragmen RNA pada sampel 27 masih cukup utuh untuk diamplifikasi secara spesifik pada wilayah target gen C–prM yang dirancang [5] [6]. Kemungkinan besar, hal ini terjadi dikarenakan sampel 27 memiliki titer atau jumlah salinan (copy number) RNA virus yang relatif lebih tinggi dibandingkan sampel lain sejak awal pengambilan, sehingga meskipun mengalami penyimpanan, jumlah RNA target yang tersisa masih berada di atas ambang deteksi RT-PCR. Penjelasan ini sejalan dengan temuan bahwa kegagalan deteksi pada metode molekuler dengue paling sering ter-jadi pada sampel dengan jumlah salinan virus yang rendah (<50 kopi), sementara sampel dengan titer virus lebih tinggi cenderung tetap terdeteksi meskipun kualitas RNA-nya sudah menurun [20].

Ketidakmunculan pita DNA target pada 29 sampel lainnya kemungkinan besar berkaitan dengan penurunan kualitas RNA selama penyimpanan. RNA virus dengue yang mengalami fragmentasi dapat mengurangi keberhasilan proses reverse transcription dalam membentuk cDNA. Pada RT-PCR konvensional, primer forward dan reverse harus menempel pada daerah target yang masih utuh agar amplifikasi dapat berlangsung; apabila salah satu lokasi pengikatan primer atau bagian di antara kedua primer mengalami kerusakan, produk amplifikasi tidak terbentuk secara optimal [13][14]. RT-PCR konvensional pada deteksi virus dengue umumnya menggunakan sepasang pri-mer forward dan

reverse yang menargetkan wilayah genom C–prM (capsid–premembrane), menghasilkan produk amplifikasi sekitar 511 bp. Karena mekanisme amplifikasi RT-PCR hanya melibatkan satu pasang primer yang mengapit satu daerah target tertentu, keberhasilan deteksinya sangat bergantung pada keutuhan seluruh segmen RNA di antara kedua primer tersebut [5][6]. Pada penyimpanan suhu 0–4°C, RNA virus umumnya masih relatif stabil dalam rentang waktu sekitar 24–72 jam, setelah melewati waktu tersebut, risiko degradasi bertahap meningkat, tergantung pada kondisi penanganan sampel [13][14].

Figure 2.

Gambar 2. Hasil Pemeriksaan RT-LAMP Berdasarkan Perubahan Warna

Hasil pemeriksaan RT-LAMP diamati berdasarkan perubahan warna dan intensitas pendar larutan reaksi setelah penambahan GelRed pasca-inkubasi, di mana perubahan warna menjadi merah muda disertai pendar yang lebih terang menandakan hasil positif, sedangkan warna yang tetap ungu dan tampak lebih redup menandakan hasil negatif. Perbedaan intensitas pendar ini berkaitan dengan prinsip kerja GelRed sebagai pewarna asam nukleat yang berpendar ketika berikatan dengan untai DNA hasil amplifikasi dan diamati di bawah sinar ultraviolet menggunakan UV transilluminator [26]. Semakin banyak produk amplifikasi yang terbentuk selama inkubasi pada sampel positif, semakin banyak pula molekul GelRed yang dapat berikatan dengan DNA tersebut setelah ditambahkan, sehingga pendar yang dihasilkan tampak lebih terang dibandingkan sampel negatif yang produk amplifikasinya sedikit atau tidak terbentuk sama sekali. Dari 30 sampel yang diperiksa, sebanyak 26 sampel (86,7%) menunjukkan hasil positif, sedangkan 4 sampel lainnya (13,3%), yaitu sampel S02, S24, S28, dan S30, tetap menunjukkan warna ungu dan dinyatakan negatif. Keempat sampel yang negatif tersebut tersebar pada kelompok waktu penyimpanan yang berbeda-beda (192 jam, 96 jam, dan 72 jam), sehingga tidak menunjukkan pola pengelompokan tertentu berdasarkan lama penyimpanan.

Hasil pada RT-LAMP berbeda dari RT-PCR. Metode ini tetap mampu mendeteksi virus dengue pada sebagian besar sampel, meskipun sampel-sampel tersebut telah disimpan ≥72 jam. Perbedaan ini berkaitan dengan karakteristik primer yang digunakan. RT-LAMP menempel pada enam titik berbeda di sepanjang wilayah genom target, lebih banyak dibandingkan RT-PCR konvensional yang hanya mengapit satu wilayah target tunggal (C–prM). Keberadaan beberapa titik penempelan pada RT-LAMP menyebabkan metode ini tidak sepenuhnya bergantung pada keutuhan segmen RNA panjang seperti yang diperlukan pada RT-PCR, sehingga peluang keberhasilan amplifikasinya tetap tinggi meskipun sebagian kecil fragmen RNA telah terdegradasi [8][10]. Hal ini menjadi salah satu alasan mengapa RT-LAMP pada berbagai penelitian dilaporkan memiliki sensitivitas yang lebih baik dibandingkan RT-PCR konvensional, baik pada sampel dengue dengan kondisi klinis yang beragam maupun pada sampel dengan viremia rendah atau RNA yang sudah mulai terdegradasi. [16][20].

Tabel 2. Hasil Uji McNemar terhadap Kesesuaian Deteksi antara RT-LAMP dan RT-PCR Konvensional

RT-PCR pada tabel 2 dikatakan negatif jika tidak muncul pita DNA berukuran 511 bp setelah proses elektroforesis, termasuk apabila hasilnya berupa pola smear (pita yang tidak jelas dan menyebar) akibat RNA yang sudah rusak atau terdegradasi. Dari 30 sampel yang diperiksa, hanya 1 sampel (S27, 3,3%) yang terdeteksi positif oleh kedua metode sekaligus, dan 4 sampel (S02, S24, S28, S30, 13,3%) negatif pada kedua metode; kedua kelompok ini tidak memengaruhi uji McNemar karena uji tersebut hanya menghitung sampel yang hasilnya berbeda antara dua metode. Sampel yang hasilnya berbeda berjumlah 25 (83,3%), dan seluruhnya mengarah ke satu arah yang sama, yaitu RT-LAMP positif sementara RT-PCR negatif, sedangkan arah sebaliknya (RT-PCR positif na-mun RT-LAMP negatif) tidak ditemukan sama sekali. Uji McNemar membandingkan kedua angka tersebut (25 berbanding 0) untuk menentukan apakah selisih sebesar itu terjadi karena kebetulan atau mencerminkan perbe-daan kemampuan deteksi yang nyata, dan hasilnya menunjukkan nilai p<0,001, yang berarti kemungkinan selisih ini terjadi karena kebetulan sangat kecil, yaitu kurang dari 1 berbanding 1.000.

Pola satu arah ini konsisten dengan karakteristik primer RT-LAMP yang menempel pada enam titik berbeda di sepanjang gen target, sehingga kemungkinan kegagalan amplifikasi akibat degradasi RNA jauh lebih kecil dibandingkan RT-PCR yang hanya bergantung pada satu pasang primer [8] [10]. Temuan ini sejalan dengan penelitian dengue sebelumnya yang melaporkan sensitivitas RT-LAMP setara atau lebih tinggi dibandingkan RT-PCR pada sampel klinis, termasuk pada kondisi sampel dengan viremia rendah atau kualitas RNA yang menurun [16] [20]. Dengan demikian, RT-LAMP dapat dipertimbangkan sebagai metode alternatif yang lebih andal untuk deteksi virus dengue pada kondisi sampel yang telah mengalami penundaan pemeriksaan atau penyimpanan dalam durasi cukup lama. Penelitian ini belum menyertakan kelompok sampel yang diperiksa segera setelah pengambilan (0 jam) dan menggunakan jumlah sampel yang relatif kecil pada tiap kelompok waktu penyimpanan, sehingga temuan ini masih perlu dikonfirmasi melalui penelitian dengan desain yang lebih luas.

Simpulan

Virus dengue masih dapat dideteksi pada sebagian besar sampel yang disimpan selama ≥72 jam apabila menggunakan RT-LAMP, sementara kemampuan deteksi RT-PCR konvensional pada kondisi yang sama menurun tajam. RT-LAMP menunjukkan kemampuan deteksi yang lebih tinggi dibandingkan RT-PCR konvensional, sedangkan lama penyimpanan tidak berhubungan dengan hasil deteksi RT-LAMP.

Ucapan Terima Kasih

Peneliti mengucapkan terima kasih kepada Universitas Muhammadiyah Sidoarjo, khususnya Program Studi D-IV Teknologi Laboratorium Medis, Rumah Sakit Bhayangkara Pusdik Sabhara Porong yang telah memberikan izin, fasilitas, dan bantuan selama pelaksanaan penelitian. Terima kasih pula disampaikan kepada seluruh responden, serta kepada semua pihak yang turut membantu hingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik.